موت الخلايا المبرمج والنخر في الأعضاء المحيطة بالبطينات بعد نزف تحت العنكبوتية التجريبي كما تم اكتشاف

موت الخلايا المبرمج والنخر في الأعضاء المحيطة بالبطينات بعد النزف تحت العنكبوتية التجريبي كما تم اكتشافه باستخدام الصبغة المناعية Annexin V وcaspase 3

الأهداف: الأعضاء المحيطة بالبطينات (CVOs) ضرورية لمعظم الوظائف اللاإرادية والغدد الصماء. الصدمة والنزيف يمكن أن تؤثر على وظيفتها. كان الهدف من هذه الدراسة هو دراسة موت الخلايا المبرمج والنخر في CVOs في الفترة المبكرة بعد النزف تحت العنكبوتية التجريبي (SAH) في الفئران، وذلك باستخدام تقارب Annexin V وcaspase 3 المناعي.

الطرق: تم استخدام ثلاث مجموعات تجريبية: اليوم الأول والثاني بعد SAH، ومجموعة مراقبة، سبعة فئران ويستار ألبينو لكل منها. تم إجراء النزف تحت العنكبوتية عن طريق ثقب الشريان القاعدي عبر الشريان. تم تزويد الفئران بـ 0.9٪ كلوريد الصوديوم و0.1 م فوسفات عازلة درجة الحموضة 7.4 حتى توقف القلب. تم قياس موت الخلايا المبرمج والنخر في الخلايا الجذعية السرطانية عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام تلطيخ Annexin V، وعن طريق الصبغ المناعي لكاسبيز 3.

النتائج: موت الخلايا المبرمج في الصفيحة الانتهائية للعضوية الوعائية (OVLT) ، كان البروز المتوسط ​​(ME)، ومنطقة ما بعد البعد (AP) أعلى بكثير في مجموعة اليوم الأول منها في مجموعة التحكم. كان موت الخلايا المبرمج في العضو تحت القحف (SFO)، وOVLT، وME، وAP أعلى بكثير في مجموعة اليوم الثاني منه في مجموعة التحكم. كانت هناك اختلافات كبيرة بين مجموعات اليوم 1 واليوم 2، باستثناء AP. كان النخر في SFO وOVLT أعلى بكثير في مجموعة اليوم الثاني منه في اليوم الأول أو مجموعات التحكم، في حين أن النخر في ME وAP لم يختلف بين المجموعات الثلاث . كانت كثافة الخلايا الإيجابية لـ Caspase 3 أكثر كثافة في مجموعة اليوم الثاني منها في اليوم الأول ومجموعات التحكم.

المناقشة: من المحتمل أن تؤدي الوقاية من موت الخلايا المبرمج إلى تحسين وظائف الخلايا الجذعية السرطانية الضعيفة بعد SAH.

مقدمة

موت الخلايا المبرمج هو موت الخلايا المبرمج، والذي يتغير في الحالات المرضية مثل النزف تحت العنكبوتية (SAH) .1 يُعتقد أن موت الخلايا المبرمج هو عامل مساهم في التسبب في إصابات الدماغ المبكرة، 2 والتشنج الوعائي، 3 واحتشاءات الدماغ 4 التي تظهر بعد SAH. في الأدبيات، هناك تقارير عن موت الخلايا المبرمج 1،2،5،6 ونخر 7،8 بعد SAH، وتحسينات في هذه بعد إعطاء مثبطات موت الخلايا المبرمج.5،6 وقد أظهرت الدراسات د أن تثبيط مسارات موت الخلايا المبرمج بعد SAH لم يقلل فقط من الموت الخلوي

ولكنه أدى أيضًا إلى تحسن كبير في النتائج الوظيفية،2،4 وبالتالي قد يؤدي إلى قمع العديد من الإصابات الثانوية المرتبطة بـ SAH.1

إلى جانب العديد من المراكز القيمة في الدماغ، هناك عدد من الأعضاء الحسية المحيطة بالبطينات (CVOs)، مثل العضو تحت القفص (SFO) ، الصفيحة العضوية الوعائية الانتهائية (OVLT)، والمنطقة الخلفية (AP)، والبروز المتوسط ​​ (ME، وهو CVO إفرازي)، تتأثر بـ SAH. قوي>9,10 الأعضاء المحيطة بالبطينات غنية بالنواقل العصبية وهي خالية من حاجز الدم في الدماغ.11,12

 

لقد ثبت أن الملحق V يتفاعل بقوة و على وجه التحديد مع الفوسفاتيديل سيرين، وبالتالي يمكن استخدامه للكشف عن موت الخلايا المبرمج المبكر.15 المناعي كاسباس 3 هو طريقة أخرى تستخدم حاليًا للكشف عن موت الخلايا المبرمج في عينات الأنسجة.16

في هذه الدراسة، قمنا بدراسة وجود موت الخلايا المبرمج المبكر والمتأخر موت الخلايا المبرمج / النخر عن طريق تقارب Annexin V و caspase 3 المناعي في CVOs بعد SAH التجريبي في الفئران. في مراجعتنا للأدبيات، فشلنا في العثور على أي تقرير سابق يتناول هذا الموضوع.

المواد والأساليب

تمت الموافقة على بروتوكول الدراسة من قبل Bu ¨لجنة أخلاقيات الحيوان بجامعة بولنت أجاويد.

تم إجراء التجارب في مختبر الجراحة التجريبية والأبحاث والحيوان بجامعة بولنت أجاويد، كلية الطب، زونجولداك، تركيا. في المجمل، تم تضمين 21 ذكرًا بالغًا من فئران ويستار البيضاء، بوزن 200-300 جرام، في الدراسة. تم الاحتفاظ بجميع الفئران عند درجة حرارة 22-25 درجة مئوية مع رطوبة مناسبة، في دورة الضوء / الظلام لمدة 12/12 ساعة، وتم إعطاؤها السوائل والطعام حسب الرغبة. تم تقسيم الفئران إلى ثلاث مجموعات على النحو التالي: اليوم الأول بعد SAH (العدد 5 7)، اليوم الثاني بعد SAH (العدد 5 7) والضوابط (العدد 5 7).

تم تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من الكيتامين (60 مجم / كجم) والزيلازين (10 مجم / كجم) . تم إجراء عملية SAH التجريبية باستخدام تقنية مشابهة لتلك التي وصفها باري وآخرون، 17 والتي تم وصفها سابقًا.9،10

لفترة وجيزة، تم إجراء شق عنق الرحم في خط الوسط في وضع الاستلقاء، تحت عملية جراحية المجهر (Takagi OM-5، اليابان)، وتم تعريض المنحدر باستخدام طريقة البلعوم الأمامية. نافذة عظمية تم إنشاء الجزء الأمامي من الشريان القاعدي باستخدام إبر كبيرة التجويف، مع الحرص الشديد على عدم فتح الصهريج السابق. تم إدخال إبرة خياطة يبلغ قطرها الخارجي 75 ملم (Ethicon, Livingston, UK) في الشريان القاعدي. تسبب سحب الإبرة في حدوث نزيف واسع النطاق في الحيز تحت العنكبوتية، مع توزيع متساوٍ حتى المنطقة الشمية. تم إبقاء الفئران على قيد الحياة لمدة يوم ويومين بعد SAH في ظل ظروف مناسبة.

تم القتل الرحيم للفئران عن طريق التروية. تحت التخدير، تم إجراء بضع الصدر، ثم تم تقني البطين الأيسر، وتثبيت الشريان الأبهر النازل، وشق الأذين الأيمن، وغسل الدم من مناطق الرأس وعنق الرحم باستخدام 0.9% كلوريد الصوديوم و0.1 مولار فوسفات عازل <قوي> (الرقم الهيدروجيني 7.4). حتى يتوقف القلب. تم قطع رأس الحيوانات، وتم الحصول على عينات من SFO، وOVLT، وME، وAP باستخدام أطلس التجسيمي للفئران (Paxinos & Watson).

مبدأ طريقة Annexin V هو قياس مدى تقارب Annexin V مع الفوسفاتيديل سيرين، من خلال قياس التدفق الخلوي، والذي ينتقل من الغشاء الداخلي للبلازما إلى النشرة الخارجية أثناء

موت الخلايا المبرمج.15 تم حصاد الخلايا من مختلف CVO

قوية > بشكل منفصل. استخدمنا تعليق خلية 100 مل لكل عينة. Annexin V مترافق مع إيزوثيوسيانات الفلورسين (FITC) - خلايا موت الخلايا المبرمج الملطخة في وجود يوديد البروبيديوم (PI). يتيح هذا التفاعل اكتشاف الفوسفاتيديل سيرين على سطح الخلايا المبرمج. أشارت كل من الخلايا الإيجابية PI والخلايا الإيجابية Annexin V إلى النسبة المئوية لحالة النخر. استخدمنا مجموعة الملحقات التجارية FITC (Beckman-Coulter, Fullerton, CA, USA) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة، وCoulter FC500 > مقياس التدفق الخلوي (بيكمان-كولتر). يظهر الشكل 1 عرضًا تخطيطيًا لفقدان عدم تناسق الدهون الغشائية أثناء موت الخلايا المبرمج المبكر والارتباط المحدد للملحق V بالفوسفاتيديل سيرين. 1. تشير الخلايا الإيجابية PI والخلايا الإيجابية Annexin V إلى موت الخلايا المبرمج المتأخر أو النخر (الشكل 1).

للتحليل النسيجي المرضي والكيميائي المناعي، CVOs تم استخدام التي تم الحصول عليها من أدمغة الفئران لجميع المجموعات. تم تثبيت عينات الأعضاء المحيطة بالبطين من كل فأر في محلول فورمالين محايد بنسبة 10٪، ثم تم تضمينها في شمع البارافين. تم قطع المقاطع على ناظم البرد عند 5-6 ملم سماكة تمت بعد ذلك إزالة الشمع من أقسام الأنسجة وصبغها بالهيماتوكسيلين والأيوسين (H&E) والكريسيل البنفسجي للتحليل النسيجي. تم تقييم الأعضاء المحيطة بالبطينات تحت المجهر الضوئي بواسطة أخصائي علم الأمراض واحد (FB) أعمى عن مجموعات الدراسة. تم إجراء التحليل الكيميائي المناعي باستخدام الأجسام المضادة متعددة النسائل anticaspase 3 (CPP32) (Neomarkers، Cat #RB-1197R7، Fremont، CA، USA) أيضًا لتقييم موت الخلايا المبرمج. اعتمد التلطيخ المناعي على تقنية الستربتافيدين البيوتين بيروكسيديز المعقدة مع استرجاع مستضد الموجات الدقيقة باستخدام أنسجة مضمنة بشمع البارافين وثابتة الفورمالين. تم جمع المقاطع المضمنة بالشمع على شرائح ثم تمت إزالة الشمع منها وترطيبها. بعد إزالة الشمع، تمت معالجة المقاطع باستخدام بيروكسيداز 10% في الماء المفلتر لمنع نشاط البيروكسيداز الداخلي. لاسترجاع المستضد، تم غلي الشرائح باستخدام 10 مليمول/لتر من محلول سترات (الرقم الهيدروجيني 7) لمدة 10 دقائق في الميكروويف. تم بعد ذلك تحضين الشرائح باستخدام الأمصال المضادة الأولية، بما في ذلك الجسم المضاد متعدد النسيلة للأرانب كاسباس 3 (Neomarkers, Cat #RB1197-R7, Fremont, CA, USA). بعد الغسيل في محلول ملحي بالفوسفات، تم تحضين الأنسجة الموجودة على الشرائح بجسم مضاد ثانوي مترافق مع البيوتين، تليها الحضانة في مكونات نظام البيوتين الستربتافيدين لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أصبحت التفاعلات مرئية بعد غمر العينات في 3،39-ديامينوبنزيدين رباعي هيدروكلوريد (DAB; Lab Vision, Fremont, CA, USA). بعد ذلك، تم تلوين المقاطع بالهيماتوكسيلين، ثم شطفها وتركيبها. تم حذف الجسم المضاد الأولي للتحكم السلبي، وتم استخدام أنسجة اللوزتين كعنصر تحكم إيجابي. وقد لوحظت النشاط المناعي لـ Caspase 3 في الغالب في السيتوبلازم مع بعض التلطيخ النووي. تم تقييم الشرائح بطريقة عمياء بواسطة أخصائي علم الأمراض واحد (FB). تم تقييم موت الخلايا المبرمج، كما تم قياسه بكثافة الخلايا الإيجابية للكاسبيز 3، في CVOs لكل مجموعة.

التحليل الإحصائي

الحزمة الإحصائية للعلوم الاجتماعية تم استخدام (الإصدار 19.0؛ SPSS Inc، Chicago، IL، USA) لجميع تحليلات البيانات. تم التعبير عن النتائج على أنها الوسيط والمدى. تم استخدام اختبار شابيرو-ويلك لاختبار الحالة الطبيعية للمتغيرات دون التوزيع الطبيعي، وتم استخدام اختبار كروسكال-واليس لإجراء المقارنات بين المجموعات الثلاث. كان اختبار كونوفر تستخدم لإجراء مقارنات ما بعد المخصصة. بالنسبة لجميع المقارنات الإحصائية، تم اعتبار 0.05 إحصائيًا.

النتائج

تم تلخيص نتائج قياس التدفق الخلوي في الجدول 1. الرسومات التي تم الحصول عليها من PI/annexin الهامة V تحليل التدفق الخلوي لـ SFO، وOVLT، وME، وAP (مجموعات التحكم واليوم الثاني) موضحة في الشكل 1. 2. في مجموعة اليوم الأول، كانت نتائج موت الخلايا المبرمج المبكرة، الموضحة بالمتوسط (النطاق)، كما يلي: OVLT 0.50% (0.08–1.89)، ME 0.55% (0.21–0.84)، وAP 0.46% (0.20–1.86)، موت الخلايا المبرمج في SFO لم تختلف بشكل كبير عن تلك الموجودة في المجموعة الضابطة. بالنسبة لمجموعة اليوم الثاني، كان موت الخلايا المبرمج المبكر على النحو التالي: SFO 1.88% (0.97-2.99)، OVLT 1.85% (0.77-3.16)، ME 0.79% (0.54-1.43)، وAP 0.82% (0.19-1.49) ). )، والتي كانت أعلى بكثير في جميع المجالات الأربعة مما كانت عليه في المجموعة الضابطة. في المجموعة الضابطة، كان موت الخلايا المبرمج المبكر 0.12% (0.02-0.35) في SFO، 0.15% (0.04-0.71) في OVLT، 0.18% (0.09-0.34) > في الشرق الأوسط، و 0.06% (0.01–0.24) في منطقة AP.

النخر في SFO وOVLT في مجموعة اليوم الثاني كانت أعلى بكثير مما كانت عليه في كل من اليوم الأول ومجموعات المراقبة، وكانت نتائج ME وAP لم يختلف بين اليوم الأول ومجموعات المراقبة

أظهر الفحص النسيجي المرضي لأقسام SFO وOVLT وME و وAP فقدانًا أكثر وضوحًا للخلايا في مجموعة اليوم الثاني منه في مجموعة اليوم الثاني. المجموعات الأخرى.

كانت كثافة الخلايا الإيجابية لـ Caspase 3 أكثر كثافة في مجموعة اليوم الثاني منها في المجموعتين الأخريين. كان هناك عدد قليل من الخلايا الإيجابية للكاسبيز 3 في المجموعة الضابطة، وكانت مجموعة اليوم الأول تحتوي على عدد أقل من الخلايا الإيجابية للكاسبيز 3 مقارنة بمجموعة اليوم الثاني.

مناقشة

يعد موت الخلايا المبرمج أحد آليات تطور موت الخلايا، والذي يمكن رؤيته بعد SAH السريري والتجريبي.

في هذه الدراسة CVOs بعد تجربة SAH، في الفئران، شوهد موت الخلايا المبرمج في SFO، وOVLT، وAP، وME. في مجموعة دراسة اليوم الأول، وجدنا زيادة في تقارب Annexin V للفوسفاتيديل سيرين (موت الخلايا المبرمج المبكر)في جميع CVOs باستثناء SFO. في اليوم 2 ز

_{قراءة: 0}